Título :	Producción de enzimas xilanoliticas por Aspergillus niger GS1, y expresión homóloga de una ß-xilosidasa
Autor(es):	Aldo Amaro Reyes
Palabras clave:	Enzimas xilanolíticas Hemicellulosic Hemicelulósicos Xilano Xylan Xylanolytic enzymes
Área:	BIOLOGÍA Y QUÍMICA
Fecha de publicación :	feb-2011
Facultad:	Facultad de Química
Programa académico:	Doctorado en Ciencias de los Alimentos
Resumen:	Los subproductos agrícolas hemicelulósicos son materiales altamente disponibles, los cuales representan una oportunidad para desarrollar productos de valor agregado. El xilano constituye la segunda fuente más abundante de carbono orgánico renovable de la Tierra, y se encuentra en las paredes celulares de las plantas en forma de hemicelulosa. Las endo- 1,4-ß-D-xilanasas (EC 3.2.1.8) y exo ß-xilosidasas (CE 3.2.1.37) catalizan la hidrólisis del xilano. Existe un interés creciente en la producción de enzimas xilanolíticas para aplicaciones industriales tales como la bioconversión de residuos agroindustriales a biocombustibles, edulcorantes bajos en calorías y productos farmacológicos. En este trabajo se presenta la caracterización parcial de una ß-xilosidasa purificada de A. niger GS1 expresada en un sistema fúngico, y la eficiencia de la producción de xilanasa tanto en fermentación sumergida (FSm) como en estado sólido (FES) mediante la co-transformación homóloga de A. niger AB4.1. Ambas enzimas recombinantes se expresaron en A. niger AB4.1 bajo el control del promotor gdpA y el terminador trpC de A. nidulans. Los sistemas de expresión fueron diseñados para producir enzimas recombinantes conteniendo un péptido de seis histidinas fusionado en su extremo carboxilo para purificarlas mediante cromatografía de afinidad. La ß-xilosidasa mostró un peso molecular de 90 kDa, y actividad de 4280 U mg de proteína-1 a 70°C, pH 3.6. La vida media fue de 74 min a 70ºC, la energía de activación fue de 58.9 kJ mol-1, y a 50°C se observó una estabilidad óptima a un pH de 4.0 a 5.0. Una productividad de 17,1 U L-1 h-1 fue estimada para FES, y 3.2 U L-1 h-1 para FSm calculado en el valor máximo de los títulos de xilanasa. La xilanasa recombinante obtenida por FES con fibra de poliuretano, fue purificada 5.1 veces, con una recuperación de 35.7%, mostró un peso molecular de 30 kDa, y actividad óptima (522 U mg de proteína-1) a pH 5.5 y 50°C. La ß-xilosidasa mantuvo actividad residual por encima de 83% en presencia de 10 mM de DTT, ß-mercaptoetanol, SDS, EDTA y Zn2+. La producción de una xilosidasa libre de hemicelulasas podría ofrecer algunas ventajas en aplicaciones tales como la alimentación animal, la síntesis enzimática y la industria de jugos de frutas. El sistema de expresión, utilizando espuma de poliuretano como soporte inerte, es una alternativa adecuada para la producción homóloga de una endo-xilanasa por FES, en condiciones de expresión selectiva Hemicellulosic agricultural by-products are highly available materials, which represent an opportunity to develop value added products. Xylan constitutes the second most abundant source of renewable organic carbon on Earth, and is located in the cell walls of plants in the form of hemicellulose. Endo-1,4-ß-D-xylanases (E.C. 3.2.1.8) and exo-ß-xylosidases (E.C. 3.2.1.37) catalyze the hydrolysis of xylan. There is a growing interest in the production of xylanolytic enzymes for industrial applications such as bioconversion of agro-industrial residues to biofuels, low-calorie sweeteners, and pharmacological products. This work reports the partial characterization of a purified ß-xylosidase from A. niger GS1 expressed on a fungal system and the efficiency of xylanase production under submerged (SmF) and solid-state (SSF) fermentations using the homologous co-transformed A. niger AB4.1. Both recombinant enzymes were expressed in A. niger AB4.1 under control of A. nidulans gpdA promoter and trpC terminator. Expression systems were designed to produce the recombinant enzymes containing a six-histidine peptide fused to the carboxyl end of the proteins to be purified by affinity chromatography. ß-xylosidase showed a molecular weight of 90 kDa, and activity of 4280 U mg protein-1 at 70°C, pH 3.6. Half-life was 74 min at 70ºC, activation energy was 58.9 kJ mol-1, and at 50°C optimum stability was observed at pH 4.0-5.0. A productivity of 17.1 U L-1 h-1 was estimated for SSF, and 3.2 U L-1 h-1 for SmF calculated at peak value of xylanase titers. Recombinant xylanase obtained by SSF on polyurethane fiber, was purified 5.1-fold, with 35.7% recovery, showed a molecular weight of 30 kDa and optimal activity (522 U mg protein-1) at pH 5.5 and 50 °C. ß-xylosidase kept residual activity above 83% in presence of 10 mM DTT, ß- mercaptoethanol, SDS, EDTA and Zn2+. Production of a hemicellulolytic free xylosidase could give some advantages in applications such as animal feed, enzymatic synthesis and the fruit juice industry. The expression system, using PF as inert support, is a suitable alternative for production of homologous endo-xylanase by SSF, under conditions of selective expression of a single xylanase
URI:	http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/273
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