Título :	Manipulación de los contenidos de carotenoides mediante la expresión del gen β--licopeno ciclasa (lcy-b) en cloroplastos de plantas de tabaco y tomate
Autor(es):	Erika Camacho Beltran
Palabras clave:	Biosintesis de carotenoides Carotenoid biosynthesis Chloroplast Cloroplasto Plastid transformation Transformación plastídica
Área:	BIOLOGÍA Y QUÍMICA
Fecha de publicación :	abr-2008
Facultad:	Facultad de Química
Programa académico:	Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos
Resumen:	La transformación genética de cloroplastos ofrece ventajas con respecto a la transformación genética nuclear: altos niveles del transgen debido a la presencia de ~10,000 copias del genoma, organización de genes en operones, incorporación del transgen por recombinación homóloga en una zona precisa y conocida evitando efectos epigenéticos, presencia de transmisión uniparental lo que evita la posible dispersión del transgen vía polen y existencia de sistemas de eliminación del marcador de selección después de la transformación. Una de las principales rutas metabólicas en plantas es la biosíntesis de carotenoides, que son compuestos que actúan como agentes pigmentantes y nutracéuticos (por sus propiedades anticancerígenas y porque son precursores de vitamina A). En este trabajo se propuso la modificación de la ruta metabólica de los carotenoides mediante la expresión del gen de la ¿-licopeno ciclasa (Lcy-b) de Tagetes erecta en el genoma de cloroplastos de plantas de tabaco y tomate. La región codificante de la Lcy-b fue incorporada en el vector pHK30 y regulada por el promotor RNAr plastídico (Prrn) y una región 3¿-no traducida de la subunidad ¿¿de la ATP sintasa (atpB) para una eficiente trascripción y estabilización de RNAm. El vector cuenta además con dos secuencias de recombinación homóloga trnV y 3`-rps12/7, que flanquean los genes Lcy-b y aadA. Se establecieron las condiciones y se bombardearon explantes de Nicotiana tabacum y Lycopersicon esculentum con los DNA plasmídicos. En el caso de tomate se bombardearon 1600 explantes y se obtuvieron 30 brotes resistentes a espectinomicina; sin embargo, no fue posible regenerarlos. En tabaco se bombardearon 130 explantes que permitieron la regeneración de 20 plantas transformadas. El análisis Southern blot confirmó la integración de Lcy-b en el genoma plastídico de plantas de Nicotiana tabacum. Se confirmó la expresión del mensajero en cloroplasto mediante el análisis Northern blot, encontrando la presencia de dos transcritos correspondientes al RNAm monocistrónico que contenía el gen Prrn (0.9 kb) y el RNAm dicistrónico que contenía el gen aadA (2.0kb). El análisis de las plantas transplastómicas de Nicotiana tabacum mostró cambios en la composición de carotenoides, confirmando el fenotipo esperado. Chloroplast genetic transformation offers advantages over nuclear genetic transformation: high transgen accumulation levels (~ 10, 000 genomic copies), genes are organized in operons, transgen integration by homologue recombination in a precise zone of the genome, avoiding epigenetic effects, uniparental transmission avoiding possible transgen dispersion through pollen, and existence of various systems capable of selecting markers elimination once transformation has taken place. In plants, one of the major metabolic pathways is carotenoids biosynthesis, they are important compounds that act as pigmenting agents and nutraceuticals (due to their anticarcinogenic properties and because they are vitamin A precursors). The aim of the present work was the modification of carotenoids pathway through the expression of the licopene ¿-cyclase gene (Lcy-b) from Tagetes erecta in tobacco and tomato chloroplast genome. The coding region of licopene ¿-cyclase was incorporated in pHK30 vector and regulated by a plastidic rRNA promoter (Prrn) and a 3¿-untranslated of ATP synthase ¿-subunit (atpB), for an efficient transcription and stabilization of mRNA. Two homologue recombination sequences trnV and 3¿-rps12/7 flanking the Lcy-b and aadA (spectinomicyn resistence), were also included in the transformation vector. Conditions were established and explants from Nicotiana tabacum and Lycopersicon esculentum were bombarded with plasmid DNA. 1600 tomato explants were bombarded, obtaining 30 spectinomicyn resistant shoots, however it was not possible to regenerate these explants. For tobacco, 130 explants were bombarded, they were capable of regeneration, obtaining 20 transformated plants. Southern blot analysis confirmed Lcy-b stable integration in the plastidic genome of Nicotiana tabacum plants. Expression of messenger RNA was confirmed in chloroplast by Northern blot analysis, the presence of two transcripts corresponding to monocistronic mRNA, containing the Prrn gene (0.9 kb) and dicistronic mRNA containing the aadA gene (2.0 kb) was detected. The analysis of transplastomic plants of Nicotiana tabacum demonstrated changes in carotenoid composition, confirming the expected phenotypes.
URI:	http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/633
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