Las peroxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de diversas moléculas donadoras de hidrógeno en presencia de H2O2. La peroxidasa de rábano picante (HRPC) ha sido el ejemplo típico de una peroxidasa de plantas clase III, debido en parte a su uso en todo el mundo en inmunodiagnósticos y en ensayos como enzima reportera. Existe una demanda de nuevas peroxidasas más estables y con mejores propiedades catalíticas. Una fuente alternativa de peroxidasas es el nabo (Brassica napus), ya que algunas isoformas son capaces de polimerizar compuestos fenólicos de aguas residuales con alta eficiencia o pueden ser usadas en reacciones de diagnóstico; sin embargo, el proceso de extracción y purificación es complejo y se obtienen bajos rendimientos de proteína activa. Nuestro grupo de investigación ha clonado un cDNA de peroxidasa de nabo (B. napus L. var. purple top white globe, BnPA) con anterioridad, lo que ha abierto la posibilidad de producir la proteína recombinante en E. coli. El objetivo de este proyecto es clonar el gen de una peroxidasa de nabo en un vector de expresión bacteriano, expresar y purificar a la proteína recombinante. El gen de la peroxidasa se fusionó con un hexámero de histidinas para facilitar su purificación mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). El rendimiento de peroxidasa recombinante pura fue de 29 mg/l de cultivo, acumulada como cuerpos de inclusión. Después de un paso de replegamiento bajo condiciones oxidantes, la enzima presentó una actividad específica de 981 unidades de ABTS/mg en condiciones óptimas (45¿C, pH 6.0). El valor de Km para ABTS fue de 0.33 mM y la eficiencia catalítica (Kcat / Km) fue de 5.2x106 M-1 s-1. El porcentaje de estructura secundaria evaluada por dicroísmo circular fue: 20% de ¿-hélice, 32% de ¿- plegada y 48% de aleatoria. El alto rendimiento y buenas propiedades cinéticas de la BnPA recombinante son piezas claves y marcan el inicio para futuros estudios de estructura-función, ingeniería de proteínas y aplicaciones biotecnológicas
Peroxidases are enzymes that catalyze oxidoreduction between H2O2 and various reductants. Horseradish peroxidase (HRPC) has been the archetypal example of a class III higher plant peroxidase, due to its worldwide use in immunodiagnostic kits and assays as reporter enzyme. However, there is a demand for more stable new peroxidases and with better catalytic properties. A good alternative source of peroxidases is turnip (Brassica napus) roots, because some isoforms are able to polymerize phenolic compounds from wastewaters with a high efficiency or may be used in diagnostic kits. However this process becomes difficult and tedious and the production yields of active protein usually are low. We have previously isolated and cloned a peroxidase cDNA from turnip (B. napus L. var. purple top white globe) roots and we are trying to produce the recombinant protein in an expression system. Nowadays, researchers are trying to obtain genomic DNA or cDNA encoding peroxidase to elucidate its physiological role, mechanism of action and the 3-D structure of the different isoenzymes. The aim of this work was to clone the peroxidase BnPA gen in a prokaryotic vector and to express and purify the recombinant protein. BnPA purification will be by immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC). The yield of pure BnPA was 29 mg/l culture and was accumulated as inclusion bodies. After a refolding step under oxidative conditions the activity peroxidase was recovered. Maximum value of pH was 6 while optimum temperature was 45°C. The ABTS Km was 0.33 mM and the catalytic efficiency was 5.2x106 M-1 s-1. The secondary structure evaluated by circular dichroism comprised 20% ¿-helix, 32% ß-sheet and 48% random structure. The high yield and good kinetic properties of the recombinant BnPA are key steps for future structure-function studies and biotechnological applications
