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dc.rights.license http://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0 es_ES
dc.contributor Carlos Regalado Gonzalez es_ES
dc.creator Norma Azucena Rodriguez Cabrera es_ES
dc.date 2011-09
dc.date.accessioned 2018-12-14T06:21:17Z
dc.date.available 2018-12-14T06:21:17Z
dc.date.issued 2011-09
dc.identifier.uri http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/555
dc.description Las peroxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de diversas moléculas donadoras de hidrógeno en presencia de H2O2. La peroxidasa de rábano picante (HRPC) ha sido el ejemplo típico de una peroxidasa de plantas clase III, debido en parte a su uso en todo el mundo en inmunodiagnósticos y en ensayos como enzima reportera. Existe una demanda de nuevas peroxidasas más estables y con mejores propiedades catalíticas. Una fuente alternativa de peroxidasas es el nabo (Brassica napus), ya que algunas isoformas son capaces de polimerizar compuestos fenólicos de aguas residuales con alta eficiencia o pueden ser usadas en reacciones de diagnóstico; sin embargo, el proceso de extracción y purificación es complejo y se obtienen bajos rendimientos de proteína activa. Nuestro grupo de investigación ha clonado un cDNA de peroxidasa de nabo (B. napus L. var. purple top white globe, BnPA) con anterioridad, lo que ha abierto la posibilidad de producir la proteína recombinante en E. coli. El objetivo de este proyecto es clonar el gen de una peroxidasa de nabo en un vector de expresión bacteriano, expresar y purificar a la proteína recombinante. El gen de la peroxidasa se fusionó con un hexámero de histidinas para facilitar su purificación mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). El rendimiento de peroxidasa recombinante pura fue de 29 mg/l de cultivo, acumulada como cuerpos de inclusión. Después de un paso de replegamiento bajo condiciones oxidantes, la enzima presentó una actividad específica de 981 unidades de ABTS/mg en condiciones óptimas (45¿C, pH 6.0). El valor de Km para ABTS fue de 0.33 mM y la eficiencia catalítica (Kcat / Km) fue de 5.2x106 M-1 s-1. El porcentaje de estructura secundaria evaluada por dicroísmo circular fue: 20% de ¿-hélice, 32% de ¿- plegada y 48% de aleatoria. El alto rendimiento y buenas propiedades cinéticas de la BnPA recombinante son piezas claves y marcan el inicio para futuros estudios de estructura-función, ingeniería de proteínas y aplicaciones biotecnológicas es_ES
dc.description Peroxidases are enzymes that catalyze oxidoreduction between H2O2 and various reductants. Horseradish peroxidase (HRPC) has been the archetypal example of a class III higher plant peroxidase, due to its worldwide use in immunodiagnostic kits and assays as reporter enzyme. However, there is a demand for more stable new peroxidases and with better catalytic properties. A good alternative source of peroxidases is turnip (Brassica napus) roots, because some isoforms are able to polymerize phenolic compounds from wastewaters with a high efficiency or may be used in diagnostic kits. However this process becomes difficult and tedious and the production yields of active protein usually are low. We have previously isolated and cloned a peroxidase cDNA from turnip (B. napus L. var. purple top white globe) roots and we are trying to produce the recombinant protein in an expression system. Nowadays, researchers are trying to obtain genomic DNA or cDNA encoding peroxidase to elucidate its physiological role, mechanism of action and the 3-D structure of the different isoenzymes. The aim of this work was to clone the peroxidase BnPA gen in a prokaryotic vector and to express and purify the recombinant protein. BnPA purification will be by immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC). The yield of pure BnPA was 29 mg/l culture and was accumulated as inclusion bodies. After a refolding step under oxidative conditions the activity peroxidase was recovered. Maximum value of pH was 6 while optimum temperature was 45°C. The ABTS Km was 0.33 mM and the catalytic efficiency was 5.2x106 M-1 s-1. The secondary structure evaluated by circular dichroism comprised 20% ¿-helix, 32% ß-sheet and 48% random structure. The high yield and good kinetic properties of the recombinant BnPA are key steps for future structure-function studies and biotechnological applications es_ES
dc.format Adobe PDF es_ES
dc.language.iso Español es_ES
dc.relation.requires Si es_ES
dc.rights Acceso Abierto es_ES
dc.subject Actividad enzimática es_ES
dc.subject Enzyme activity es_ES
dc.subject Over-expression es_ES
dc.subject Peroxidasa de nabo recombinante es_ES
dc.subject Recombinant bnpa peroxidase es_ES
dc.subject Sobrexpresión es_ES
dc.subject.classification BIOLOGÍA Y QUÍMICA es_ES
dc.title Expresión y caracterización de una peroxidasa recombinante de nabo (Brassica napus) en un sistema bacteriano es_ES
dc.type Tesis de doctorado es_ES
dc.creator.tid curp es_ES
dc.contributor.tid curp es_ES
dc.creator.identificador ROCN791128MDFDBR04 es_ES
dc.contributor.identificador REGC550803HQTGNR01 es_ES
dc.contributor.role Director es_ES
dc.degree.name Doctorado en Ciencias de los Alimentos es_ES
dc.degree.department Facultad de Química es_ES
dc.degree.level Doctorado es_ES


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Nombre: RI003665.PDF
Tamaño: 4.659Mb
Formato: PDF
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