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5. Licenciatura en Microbiología

Título:	Prueba rápida para la detección de Pseudomonas aeruginosa.
Autor(es):	Daniel Alejandro Ferrusca Bernal
Palabras clave:	Pseudomonas aeruginosa LAMP RLBH
Área:	BIOLOGÍA Y QUÍMICA
Fecha de publicación :	11-ene-2026
Páginas:	1 recurso en línea (56 páginas)
Folio RI:	CNLIN-220496
Facultad:	Facultad de Ciencias Naturales
Programa académico:	Licenciatura en Microbiología
Resumen:	Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, el cual tiene importancia a nivel de salud pública, debido a ser el agente causante de infecciones severas en personas con condiciones médicas subyacentes; tales como en pacientes hospitalizados, pacientes quemados, inmunocomprometidos. Las estrategias efectivas de control de las infecciones causadas por P. aeruginosa deben de incluir la detección temprana y específica de la infección, así como la determinación de la sensibilidad a antibióticos del patógeno; mediante técnicas de diagnóstico sensibles, específicas, económicas y rápidas. Los métodos tradicionales para la identificación son el análisis microbiano; que cubre el aislamiento, crecimiento y detección mediante pruebas bioquímicas, un procedimiento con una duración aproximada de al menos 72 horas. Por lo mencionado surge la necesidad de implementar una técnica de diagnóstico específica y reproducible, la cual tenga la ventaja de ser más sensible y rápida a los actuales métodos de diagnóstico clínico. La técnica de Amplificación Isotérmica Mediada por Horquillas (LAMP) amplifica una secuencia blanco bajo condiciones isotérmicas en una hora, con una alta sensibilidad y especificidad; permitiendo de diversas maneras la detección del material genético amplificado. El objetivo del presente trabajo fue implementar y estandarizar la técnica de Amplificación Isotérmica Mediada por Horquillas (LAMP), acoplada a la técnica de Hibridación por Transferencia en Línea Reversa (RLBH) para el diagnóstico, mediante la hibridación de sondas de oligonucleótidos especie-específico con los productos de LAMP biotinilados, para la detección del patógeno. Para implementar la técnica, primero se diseñó una sonda de oligonucleótidos específica para el gen 16S rRNA de P. aeruginosa, para posteriormente hacer el envío para su síntesis. Posterior a la síntesis de las sondas, se obtuvieron 40 muestras de DNA de P. aeruginosa, gracias a la donación del Cepario del Laboratorio de Inmunología y Vacunas lugar donde se llevó a cabo la presente investigación. La concentración de DNA así como su integridad de las muestras se determinó mediante espectrofotometría y gel de integridad en agarosa, para posteriormente determinar la sensibilidad de las técnicas de PCR y LAMP por separado, utilizando una concentración conocida de 30 ng/µL de DNA de cada muestra de P. aeruginosa. A partir de la concentración conocida de 30 ng/µL de cada una de las muestras se evaluó el límite de detección y la reproducibilidad de los métodos de PCR y LAMP mediante diluciones en serie 10^2-10^9. La especificidad analítica de los cebadores para amplificar el gen 16S rRNA se evaluó mediante los métodos de LAMP y PCR, utilizando además del DNA de P. aeruginosa, el DNA genómico de seis especies diferentes de bacterias intrahospitalarias de importancia clínica. Además, se evaluó el tiempo mínimo requerido para la detección del patógeno, incubando las reacciones LAMP y PCR a 0, 15, 30, 45 y 60 minutos, para determinar el tiempo mínimo requerido para la amplificación y detección del producto amplificado mediante ambas técnicas. Finalmente se evaluó la técnica de RLBH acoplada a la técnica de LAMP con los productos amplificados de cada una de las muestras de DNA; para ello se realizó la hibridación de los productos de LAMP y la sonda especie específica antes mencionada en una membrana de nylon (Byodine C). La detección de P. aeruginosa mediante la presente prueba abarca un tiempo promedio de 2 horas con un costo aproximado de $250.00 M.N. para la detección del patógeno así como para su posible determinación de sensibilidad a antibióticos; en cambio mediante las técnicas actuales de detección bioquímicas mediante el equipo automatizado Vitek II, se obtienen resultados en un tiempo promedio de 72 horas y con un costo aproximado de $350.00 M.N. para solo la detección del patógeno implicado; lográndose obtener de esta manera una alternativa de diagnóstico más rápida y menos costosa en comparación a las técnicas actuales de diagnóstico, para la detección de P. aeruginosa. La sensibilidad del método LAMP-RLBH fue de 3x10^4 ng/µL, para LAMP fue de 3x10^3 ng/µL, mientras que en el método de PCR fue de 0.03 ng/µL; de igual manera se demostró que estas tres técnicas amplifican de forma específica el gen 16S rRNA de P. aeruginosa. El presente trabajo de investigación proporciona una técnica que puede llevarse a cabo de manera simple, por personal sin experiencia, logrando una alternativa viable más rápida y económica en comparación a los métodos de diagnóstico tradicionales para la detección de P. aeruginosa.
URI:	http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/2623
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