Título :	"Desarrollo y estandarización de la técnica de amplificación isotérmica basada en horquillas (LAMP) para el diagnóstico de Babesia bigemina"
Autor(es):	Andrea Paola Lizarazo Zuluaga
Palabras clave:	Babesia bigemina diagnóstico molecular LAMP azul de hidroxinaftol Babesia bigemina molecular diagnosis LAMP hydroxynaphtol blue
Área:	BIOLOGÍA Y QUÍMICA
Fecha de publicación :	oct-2017
Facultad:	Facultad de Ciencias Naturales
Programa académico:	Maestría en Salud y Producción Animal Sustentable
Resumen:	"La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas causada por protozoarios parásitos del género Babesia. Esta enfermedad se caracteriza por ocasionar alta morbilidad y mortalidad a nivel mundial. De las especies de Babesia que afectan a los bovinos, B. bovis y B. bigemina son las especies con mayor prevalencia e importancia económica en el mundo debido al impacto ocasionado en la industria de producción de carne y leche. Las estrategias efectivas de control de la enfermedad deben incluir la detección de animales reservorios y la detección temprana y específica de la enfermedad utilizando técnicas de diagnóstico rápidas, económicas, sensibles y específicas. La técnica de amplificación isotérmica basada en horquillas (LAMP) es una reacción molecular de un paso que amplifica una secuencia de DNA blanco con alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones isotérmicas en el lapso de una hora, no requiere de equipos especiales y los resultados pueden ser observados por viraje colorimétrico. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar y estandarizar la técnica de LAMP para la detección de Babesia bigemina y su visualización utilizando azul de hidroxinaftol. La investigación se llevó a cabo en el laboratorio de Inmunología y Vacunas de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro y la metodología empleada incluyó: 1) el diseño y síntesis de cebadorescomo punto crítico del desarrollo de la técnica; 2) la estandarización de las condiciones de amplificación y visualización; 3) la evaluación de la sensibilidad y especificidad diagnóstica y, 4) la detección de distintas cepas de B. bigemina del mundo. Se diseñaron cebadores a partir de las secuencias conservadas del gen ama-1 de Babesia bigemina. Los resultados mostraron que, a 63°C en una hora y en condiciones estandarizadas, la técnica amplifica DNA de B. bigemina logrando el viraje colorimétrico característico. La evaluación de la sensibilidad indicó que se logra amplificar DNA a un 0.00000001% de parasitemia y se demostró que esta técnica amplifica DNA de B. bigemina de manera específica. Adicionalmente, la técnica fue capaz de amplificar DNA de 10 cepas de B. bigemina de tres países distintos. Se concluye que la técnica de LAMP desarrollada aquí es capaz de amplificar de manera específica y sensible DNA de B. bigemina, no presenta reacción cruzada con organismos relacionados y el producto es observado al término de 60 minutos de reacción por viraje colorimétrico. El presente es el primer reporte de LAMP que utiliza secuencias conservadas entre cepas del gen ama-1, demuestra los resultados por cambios de coloración utilizando azul de hidroxinaftol y prueba la capacidad de diagnóstico de cepas de otras partes del mundo. La técnica es una alternativa rápida y económica para el diagnóstico de la enfermedad causada por B. bigemina." "Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoan parasites of the genus Babesia. This disease is characterized by high morbidity and mortality worldwide. Of the Babesia species that affect cattle, B. bovis and B. bigemina are the most prevalent and economically important species in the world due to the impact on the meat and milk production industry. Effective disease control strategies should include detection of reservoir animals and early and specific disease detection using rapid, economical, sensitive and specific diagnostic techniques. The Loop-Mediated Isothermal Amplification technique (LAMP) is a one-step molecular reaction that amplifies DNA sequence with high sensitivity and specificity under isothermal conditions within one hour, requires no special equipment and the results can be observed through the naked eye by colorimetric turning. The objective of the present work was to develop and standardize the LAMP technique for the detection of Babesia bigemina and its visualization using hydroxynaphtol blue. The research was carried out in the Laboratory of Immunology and Vaccines of the Faculty of Natural Sciences of the Universidad Autónoma de Querétaro and the methodology used included: 1) the design and synthesis of primers as a critical point in the development of the technique; 2) standardization of amplification and visualization conditions; 3) the evaluation of diagnostic sensitivity and specificity and, 4) the detection of different strains of B. bigemina in the world. Primers were designed from the conserved sequences of the babesia bigemina ama-1 gene. The results showed that, at 63 °C in one hour and under standardized conditions, the technique amplifies B. bigemina DNA achieving the characteristic colorimetric change. Sensitivity evaluation indicated that DNA was amplified at a 0.00000001% parasitemia and it was demonstrated that this technique amplifies DNA of B. bigemina in a specific way. Additionally, the technique was able to amplify DNA from 10 strains of B. bigemina from three different countries. It is concluded that the LAMP technique developed here is able to amplify B. bigemina DNA specifically and has high sensitivity, does not cross-react with related organisms and the product is observed at the end of 60 minutes of reaction per colorimetric turn. The present report is the first LAMP report that uses conserved sequences between strains of the ama-1 gene, demonstrates the results by changes of coloration using hydroxynaphtol blue and has the diagnostic capacity of strains from other parts of the world. The technique is a fast and economical alternative for the diagnosis of B. bigemina disease."
URI:	http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/1403
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