La vocalización de anuros es uno de los parámetros más importantes en la comunicación social y tiene un papel muy importante en atraer hembras o competencias agresivas de individuos o conspecíficos. Los llamados de advertencia de anuros son específicos de especie y son una herramienta útil para identificar y reconocer especies cripticas, que son morfológicamente indistinguibles. Rheohyla miotympanum es una rana endémica a México que se distribuye en la Sierra Madre Oriental y forma parte del género monotípico Rheohyla. El principal objetivo de este estudio fue caracterizar la vocalización de este anuro en cuatro poblaciones de la Sierra Madre Oriental, para evidenciar si existen diferencias entre ellas. Al encontrar diferencias en la vocalización, se llevaron a cabo análisis morfológicos y moleculares para confirmar la existencia de una nueva especie. Los machos fueron grabados usando una grabadora digital Tascam DR-40 y un micrófono direccional Marantz a menos de 1 m de distancia. Se midió la temperatura, humedad relativa, distancia de la percha, presencia de otros individuos y longitud de hocico-cloaca. La estructura temporal y espectral del canto fue analizada usando Raven Pro 1.5. Se analizaron 870 llamados de advertencia de 44 machos vocalizando en cuatro sitios de México. Se analizaron ambas estructuras espectrales y temporales del canto usando nueve parámetros. Se secuenciaron tres genes mitocondriales 16S, Citocromo b y Citocromo oxidasa I para determinar la variación genética. Los llamados de advertencia están formados por una a ocho notas de tipo A o B. R. miotympanum tiene una tasa de llamado de 0.32-0.48, una frecuencia dominante de 2872.68 Hz y una duración del llamado de 0.21seg. Así mismo, comentamos algunos puntos del llamado de liberación de un macho en amplexo. Por su parte, los especímenes de Querétaro y San Luis Potosí difieren en sus secuencias 16S, Cytb y COI en 4.7%, 9% y 12% respectivamente, en comparación a los especímenes de Veracruz, así como la presencia de caracteres morfológicos diferentes. En base a las diferencias genéticas, morfológicas y de comportamiento (canto), se describen a los especímenes de San Luis Potosí y Querétaro como una nueva especie de la Sierra Madre Oriental, llamada Rheohyla orientalis.