Listeria spp. es el agente causal de la Listeriosis, enfermedad transmitida por alimentos que es poco frecuente y con una alta mortalidad. La bacteria es capaz de diseminarse a través de alimentos contaminados y por reservorios como roedores, aves, animales de abasto y de compañía. Hasta la fecha, no se sabe si los ardillones (Otospermophilus variegatus) y los tlacuaches (Didelphis virginiana) son reservorios de esta bacteria, por lo que en el presente trabajo tuvo como objetivo identificar y estimar la prevalencia de Listeria spp. en ambos especímenes. Para este estudio se utilizaron muestras rectales las cuales fueron tomadas en dos zonas para los tlacuaches: área urbana (Centro Universitario) y área periurbana (Zibatá). Mientras que las muestras de ardillones solo se tomaron en un área urbana (parque Alameda Hidalgo). La identificación de Listeria spp. se llevó a cabo mediante la amplificación del gen prfA y el gen Prs por PCR. Adicionalmente se llevó a cabo el aislamiento selectivo para Listeria spp. de los preenriquecimientos congelados en glicerol, los cuales fueron cultivados en agar PALCAM suplementados con Ceftazidima pentahidratada (15 µg/ml), las colonias obtenidas fueron identificadas mediante la secuenciación de la región ribosomal 16S. De un total de 100 muestras rectales de ardillones, 43 % resultaron ser positivos a Listeria spp. con los oligonucleótidos Lip1 y Lip2 (gen prfA) así como el 11 % con los oligonucleótidos Prs (gen Prs). Por otra parte 36 muestras rectales de tlacuaches fueron analizadas (Centro Universitario UAQ n=20; Zibatá n=16); 10.5 % resultaron ser positivos a Listeria spp. con Lip1 y Lip2 mientras que con Prs solamente 5.56 %. Los aislamientos obtenidos no fueron identificados como Listeria spp., por lo que la obtención de la bacteria no fue posible. En conclusión ambas especies pueden ser reservorios de Listeria spp. pero la mayor prevalencia se encuentra en ardillones, dichos hallazgos permiten ampliar el panorama de Listeria en ambientes naturales y antropizados.