El envenenamiento por mordedura de serpiente es un problema médico grave en diferentes áreas del mundo. En América Latina, la mayor prevalencia se debe a las serpientes de la familia Viperidae, donde se incluyen las serpientes de cascabel (Crotalus). Estos venenos producen veneno hemotóxico que causa sangrado, degradación de los tejidos y necrosis. Cada veneno presenta varias actividades enzimáticas, lo que hace que sus efectos clínicos sean difíciles de estudiar, además, la comparación entre las moléculas de veneno es difícil cuando se usan diferentes técnicas y, por lo tanto, su identificación/caracterización por la misma metodología es necesaria. En este trabajo, se realizó la caracterización bioquímica de veneno de serpiente en cuanto a serín proteasas (SVSP), fosfolipasas A2 (SVPLA2), metaloproteasas (SVMP) y hialuronidasas (SVHA) de Crotalus aquilus (Ca), Crotalus polystictus (Cp) y Crotalus molossus nigrescens (Cmn). Se observaron diferencias en el patrón de proteínas, el contenido de enzimas y las actividades enzimáticas. Todos los venenos mostraron una alta actividad de SVPLA2, SVSP de alto peso molecular y una amplia variedad de formas de SVMP y SVHA. Ca y Cp mostraron las actividades enzimáticas más altas de SVMP y SVSP tipo tripsina y quimotripsina, mientras que Cmn mostró la mayor actividad de la SVHA y SVPLA2, similar a Ca. Todos los venenos mostraron péptidos con una masa molecular similar a la de las miotoxinas tipo crotamina. No se cuenta con información previa sobre la caracterización de veneno de C. aquilus y no existen análisis previos que incluyan estas cuatro familias de proteínas en estos venenos de Crotalus.