Esta investigación evaluó el cultivo del hongo comestible Pleurotus djamor en tres sustratos alternativos (fibra de coco, cascarilla de café y residuos de poda de jitomate) comparados con el sustrato tradicional de cebada. El objetivo fue determinar cuál de estos materiales mejora la producción, calidad nutricional y contenido de metabolitos bioactivos. Los resultados demostraron que la cascarilla de café en proporción 2:10 obtuvo el mejor rendimiento (1.18 ± 0.51 g) y la mayor eficiencia biológica (118.93%), superando significativamente a la cebada (66.33%). Además, este sustrato favoreció un alto contenido de flavonoides (2.53 mg RU/g) y actividad antioxidante (21.08 mg Trolox/g en DPPH). En cuanto a propiedades nutricionales, la poda de jitomate 6:10 destacó por su alto porcentaje de proteínas (9.75%), mientras que la fibra de coco 8:10 registró mayor contenido de lípidos (2.54%). Asimismo, los análisis fisicoquímicos revelaron que estos sustratos retienen mejor la humedad y presentan mayor concentración de minerales (cenizas) en comparación con la cebada. El estudio de metabolitos secundarios mediante GC-MS identificó compuestos bioactivos como ácido linoleico y octadecanoico, con potenciales beneficios antifúngicos, antiinflamatorios e hipolipidémicos. Finalmente, el análisis colorimétrico mostró variaciones en la tonalidad de los hongos según el sustrato, siendo la fibra de coco la que produjo ejemplares más claros (L* = 78.38) y la cascarilla de café los más rojizos (a* = 13.00). Estos hallazgos confirman que los residuos agroindustriales no solo son una alternativa sostenible para el cultivo de P. djamor, sino que también mejoran su valor nutricional y funcional. El estudio sugiere implementar estos sustratos a escala piloto, especialmente la cascarilla de café, para optimizar la producción de hongos con aplicaciones en alimentación y biotecnología.