En Querétaro la industria vinícola ha tomado relevancia en los últimos años, no sólo por la importancia debida a la producción de vino, sino también por el desarrollo del enoturismo. Durante su cultivo, la vid está expuesta a enfermedades que pueden afectar la producción y la calidad del fruto, tal es el caso de la podredumbre gris causada por el hongo Botrytis cinerea el cual afecta hojas, tallos y frutos, siendo en este último órgano donde genera mayores daños. Se ha reportado que B. cinerea ha desarrollado resistencia a los fungicidas comúnmente empleados para la prevención y tratamiento de esta enfermedad, por lo que es necesario buscar nuevas alternativas, como el control biológico. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad antagónica de tres cepas: Bacillus methylotrophicus FR4B12, Metschnikowia pulcherrima NB9 y Naganishia diffluens FLL17 contra B. cinerea en ensayos de cultivo dual in vitro y en ensayos de control de infección de frutos de uva de vino y de mesa. Adicionalmente fue evaluada la susceptibilidad de las cepas de biocontrol a los fungicidas (Benomilo, Oxicloruro de cobre y azufre elemental) comúnmente empleados para el control de B. cinerea en viñedo. Los resultados mostraron que B. methylotrophicus FR4B12 inhibió entre 29.6 y 62.4 % el crecimiento de las cepas de B. cinerea in vitro, en tanto que en los ensayos en fruto cv. ‘Merlot’, fue mínima la disminución de la incidencia (10.2 %), mientras que en uva de mesa ‘Sugraone’ y ‘Sweet celebration’ inhibió el crecimiento entre 88.1 y 100 %. Por su parte N. diffluens FLL17 inhibió al patógeno in vitro entre 29.8 y 39.9%, e in vivo por el contrario, favoreció el desarrollo del hongo en las tres variedades de uva. Finalmente, M. pulcherrima NB9 inhibió in vitro entre 16.2 y 31.6 %, en tanto que en uva ‘Merlot’ disminuyó la incidencia hasta en 56.9 % y en uva de mesa ‘Sugraone’ y ‘Sweet celebration’ inhibió el crecimiento entre 55.6 y 100%. B. methylotrophicus FR4B12 y M. pulcherrima NB9 no mostraron susceptibilidad in vitro a las concentraciones de los fungicidas Benomilo (5.6 g L-1) y Oxicloruro de Cobre (32 g L-1) empleadas en campo para el control de B. cinerea. Se concluye que B. methylotrophicus FR4B12 y M. pulcherrima NB9 muestran potencial para ser utilizadas como agentes de biocontrol de B. cinerea en uva.