La enfermedad Loque Americana en la abeja melífera (Apis mellifera) es causada por la bacteria Paenibacillus larvae, la cual es una preocupación ambiental importante y es considerada como la más destructiva por su fácil diseminación. Por lo anterior su diagnóstico oportuno resulta una prioridad para la apicultura y en específico en polen comercial. Por lo tanto, en este trabajo, desarrollamos una estrategia molecular de detección por la técnica de PCR basada en la amplificación del locus tRNAcys como un diagnóstico rápido y confiable para la detección de Paenibacillus larvae en polen. Los resultados obtenidos mediante la técnica de PCR mostraron que el análisis realizado en las colonias de bacterias esporuladas obtenidas de muestras de polen proveniente de México, Chile y Europa fue negativo para Paenibacillus larvae. La validación de este resultado negativo fue a través de la identificación bacteriana por MALDITOF-MS, los géneros encontrados fueron Bacillus licheniformis, B. pumilus, B. cereus, B. mycoides, B. weihenstephanensis, B. sonorensis, B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis, Paenibacillus odorifer, P. peoriae, P. polymyxa y P. cookie. Por lo tanto, este ensayo de PCR podría ser útil para estudios adicionales como método de diagnóstico para la identificación de Paenibacillus larvae como control de calidad microbiano en polen comercial mejorando su diagnóstico oportuno.