El cáncer de pulmón es una enfermedad de importancia mundial, debido a su alta tasa de mortalidad en ambos sexos. Un factor importante en el desarrollo de esta enfermedad es la presencia del fenotipo neuroendócrino el cual ha sido correlacionado con una disminución de la sobrevivencia, un incremento en el número de células tumorales así como el incremento en el porcentaje de metástasis. Un aspecto clave en el fenotipo neuroendócrino es la formación de gránulos neurosecretores con la propiedad fundamental de secretar una gran variedad de factores, como hormonas y neurotransmisores. En años recientes se ha incrementado el interés por estos factores en su tarea como inmunomoduladores, una inquietud trascendental al respecto, es identificar su labor en la comunicación multidireccional que existe dentro del microambiente tumoral.
Hasta el momento no se conoce completamente el efecto inmunomodulador de los factores secretados por el fenotipo neuroendócrino del cáncer de pulmón. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de los factores secretados por la línea de adenocarcinoma pulmonar con fenotipo neuroendócrino (A549NED), en la actividad citotóxica de células inmunes (Jurkat) in vitro.
La línea de adenocarcinoma de pulmón fue tratada con agentes que incrementan la concentración intracelular de [cAMP] hasta por 120 horas (3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, 0.5 mM), forskolina (FSK, 0.5 mM) o su combinación (I+F) para observar cambios en la adquisición del fenotipo neuroendócrino como morfología, número de neuritas, cromogranina A (CgA por FACS). Se utilizaron cocultivos y la evaluación de la liberación de fluorescencia para evidenciar la interacción de las células citotóxicas (C: Jurkat) versus células blanco (B: A549/GFP), y para observar el efecto de la diferenciación neuroendócrina en la actividad citotóxica, utilizando como células blanco a las células A549 de origen (A549CTRL) y transdiferenciadas (A549NED).
Nuestros resultados muestran cambios en la morfología de A549 (tamaño y presencia de proyecciones de tipo neurita), disminución en la tasa de proliferación, la sobreexpresión del marcador neuroendócrino Cromogranina A, y un patrón diferencial de la secreción de aminas biogénicas, observados a partir de 120 horas de tratamiento sugiriendo la generación de un fenotipo neuroendócrino terminal. La liberación de fluorescencia de las células A549/GFP después de los cocultivos B:C mostró un incremento dependiente de la proporción B:C.
La adquisición del fenotipo neuroendócrino disminuye la liberación de fluorescencia de las células blanco en cocultivos de 24 horas, sugiriendo una disminución de la citólisis. Del mismo modo, el medio condicionado por sí sólo disminuyó la proliferación y viabilidad de las células Jurkat, corroborando la importancia de la secreción de factores solubles.
Los datos actuales apoyan la generación del fenotipo neuroendócrino de la línea celular A549 (A549NED), estable por 48 horas después la retirada de agonistas de cAMP. En los cocultivos con células citotóxicas, se encontró evidencia de la disminución de la citólisis mediada por la adquisición del fenotipo neuroendócrino y los factores solubles secretados.
Lung cancer is one of the leading causes of deaths by cancer in both sexes worldwide. A primary concern of this disease is the presence of neuroendocrine phenotype which has been correlated to a decreased survival, an increased number of peripheral tumor cells and an increased percentage of metastasis. A key aspect of NE phenotype is the formation of secretory granules with the fundamental property of secreting a great variety of factors such as hormones and neurotransmitters. In recent years, there has been an increasing interest in the role of these factors as immunomodulators, and their role in the multidirectional communication within the tumor microenvironment.
It remains unclear the immunomodulator effect of factors secreted in neuroendocrine phenotype of lung cancer. The objective of this work was to test the effect of factors secreted by the lung adenocarcinoma cell line (A549NED) with neuroendocrine phenotype on the cytotoxic activity of immune cells (Jurkat) in vitro.
The human lung adenocarcinoma A549 cells were treated with [cAMP] increasing agents up to 120 hours 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, 0.5 mM), forskolin (FSK, 0.5 mM) or both (I+F) to observe the changes in the phenotype acquisition: morphology and neurite number (Light microscopy), Chromogranin A (CgA by FACS). Cocultures and fluorescence release were used to evaluate the interaction of cytotoxic activity of T lymphocytes (C: Jurkat) against target cells (T: A549/GFP) and to observe the effect of the neuroendocrine differentiation on the cytotoxic activity, using as target cells original A549 cells (A549CTRL) and transdifferentiated cells (A549NED).
Our results showed changes in the A549 cell morphology (size and presence of neurite-like projections), decreased proliferation rate, the overexpression of neuroendocrine marker chromogranin A, and a differential pattern of biogenic amines, observed in the treatments at 120 hours, suggesting the generation of a terminal neuroendocrine phenotype. The fluorescence release of A549/GFP after C: T co-cultures showed an increasing cytolytic effect that depended of C:T ratio. The neuroendocrine acquisition diminishes the fluorescence release of target cells in 24 h co-culture, indicating a decreased cytolysis. Also, the conditioned medium alone decreased proliferation and viability of Jurkat cells, suggesting the important role of soluble factors secreted.
The current data support the generation of a neuroendocrine phenotype from A549 cell line (A549NED), stable for 48 hours after cAMP stimuli withdrawal. In co-cultures with CTL, there is evidence of diminished cytolysis by means of the acquisition of the neuroendocrine phenotype and the soluble factors secreted.
