"La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas causada por
protozoarios parásitos del género Babesia. Esta enfermedad se caracteriza por
ocasionar alta morbilidad y mortalidad a nivel mundial. De las especies de Babesia
que afectan a los bovinos, B. bovis y B. bigemina son las especies con mayor
prevalencia e importancia económica en el mundo debido al impacto ocasionado en
la industria de producción de carne y leche. Las estrategias efectivas de control de la
enfermedad deben incluir la detección de animales reservorios y la detección
temprana y específica de la enfermedad utilizando técnicas de diagnóstico rápidas,
económicas, sensibles y específicas. La técnica de amplificación isotérmica basada
en horquillas (LAMP) es una reacción molecular de un paso que amplifica una
secuencia de DNA blanco con alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones
isotérmicas en el lapso de una hora, no requiere de equipos especiales y los
resultados pueden ser observados por viraje colorimétrico. El objetivo del presente
trabajo fue desarrollar y estandarizar la técnica de LAMP para la detección de Babesia
bigemina y su visualización utilizando azul de hidroxinaftol. La investigación se llevó a
cabo en el laboratorio de Inmunología y Vacunas de la Facultad de Ciencias Naturales
de la Universidad Autónoma de Querétaro y la metodología empleada incluyó: 1) el
diseño y síntesis de cebadorescomo punto crítico del desarrollo de la técnica; 2) la
estandarización de las condiciones de amplificación y visualización; 3) la evaluación
de la sensibilidad y especificidad diagnóstica y, 4) la detección de distintas cepas de
B. bigemina del mundo. Se diseñaron cebadores a partir de las secuencias
conservadas del gen ama-1 de Babesia bigemina. Los resultados mostraron que, a
63°C en una hora y en condiciones estandarizadas, la técnica amplifica DNA de B.
bigemina logrando el viraje colorimétrico característico. La evaluación de la
sensibilidad indicó que se logra amplificar DNA a un 0.00000001% de parasitemia y
se demostró que esta técnica amplifica DNA de B. bigemina de manera específica.
Adicionalmente, la técnica fue capaz de amplificar DNA de 10 cepas de B. bigemina
de tres países distintos. Se concluye que la técnica de LAMP desarrollada aquí es
capaz de amplificar de manera específica y sensible DNA de B. bigemina, no presenta reacción cruzada con organismos relacionados y el producto es observado al término
de 60 minutos de reacción por viraje colorimétrico. El presente es el primer reporte de
LAMP que utiliza secuencias conservadas entre cepas del gen ama-1, demuestra los
resultados por cambios de coloración utilizando azul de hidroxinaftol y prueba la
capacidad de diagnóstico de cepas de otras partes del mundo. La técnica es una
alternativa rápida y económica para el diagnóstico de la enfermedad causada por B.
bigemina."
"Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoan parasites of the
genus Babesia. This disease is characterized by high morbidity and mortality
worldwide. Of the Babesia species that affect cattle, B. bovis and B. bigemina are the
most prevalent and economically important species in the world due to the impact on
the meat and milk production industry. Effective disease control strategies should
include detection of reservoir animals and early and specific disease detection using
rapid, economical, sensitive and specific diagnostic techniques. The Loop-Mediated
Isothermal Amplification technique (LAMP) is a one-step molecular reaction that
amplifies DNA sequence with high sensitivity and specificity under isothermal
conditions within one hour, requires no special equipment and the results can be
observed through the naked eye by colorimetric turning. The objective of the present
work was to develop and standardize the LAMP technique for the detection of Babesia
bigemina and its visualization using hydroxynaphtol blue. The research was carried
out in the Laboratory of Immunology and Vaccines of the Faculty of Natural Sciences
of the Universidad Autónoma de Querétaro and the methodology used included: 1) the
design and synthesis of primers as a critical point in the development of the technique;
2) standardization of amplification and visualization conditions; 3) the evaluation of
diagnostic sensitivity and specificity and, 4) the detection of different strains of B.
bigemina in the world. Primers were designed from the conserved sequences of the
babesia bigemina ama-1 gene. The results showed that, at 63 °C in one hour and
under standardized conditions, the technique amplifies B. bigemina DNA achieving the
characteristic colorimetric change. Sensitivity evaluation indicated that DNA was
amplified at a 0.00000001% parasitemia and it was demonstrated that this technique
amplifies DNA of B. bigemina in a specific way. Additionally, the technique was able to
amplify DNA from 10 strains of B. bigemina from three different countries. It is
concluded that the LAMP technique developed here is able to amplify B. bigemina DNA
specifically and has high sensitivity, does not cross-react with related organisms and
the product is observed at the end of 60 minutes of reaction per colorimetric turn. The
present report is the first LAMP report that uses conserved sequences between strains
of the ama-1 gene, demonstrates the results by changes of coloration using hydroxynaphtol blue and has the diagnostic capacity of strains from other parts of the
world. The technique is a fast and economical alternative for the diagnosis of B.
bigemina disease."
