La enfermedad de las “raíces pilosas” en cultivos de tomate, caracterizada por una proliferación anormal de raíces inducida por bacterias del género Agrobacterium, representa un problema emergente. En este trabajo se aislaron y caracterizaron bacterias provenientes de la rizosfera y del sistema de riego de un invernadero en el estado de Querétaro, México con incidencia recurrente de la enfermedad. Mediante pruebas bioquímicas y análisis del gen 16S ARNr se identificaron aislados pertenecientes a las clases α-proteobacteria, β-proteobacteria y ɣ-proteobacteria, destacando los aislados rizosféricos: Agrobacterium deltaense M8R5 y Shinella sp. Ar534. Los ensayos de patogenicidad en frijol y tomate confirmaron la capacidad rizogénica de A. deltaense M8R5, la cual indujo un desarrollo radicular similar al control positivo de Agrobacterium rhizogenes K599. El análisis genómico de M8R5 reveló la presencia de un novedoso plásmido tipo Ri (pRiM8R5), el cual contiene los genes causantes de la patogenicidad (rol y vir), y otros más (addA, recB, dnaK. edd, odh, ghrB, nagR) que pudieran conferirle ventajas fisiológicas adaptativas como patógeno. En contraparte, en el análisis genómico de Shinella sp. Ar534 no se encontraron genes de virulencia, indicando que podría ser una cepa simbiótica o adaptativa. En ensayos de antagonismo in vitro contra A. deltaense M8R5, Bacillus subtilis Q11 y Bacillus sp. PEu ejercieron una respuesta competitiva, principalmente mediante movilidad dirigida y competencia por espacio a 30 y 35 °C. En los ensayos de control químico, FITO TSP ® presentó una mayor actividad inhibitoria que ® Busan 1129, aunque su uso prolongado podría favorecer la aparición de resistencia bacteriana. En conclusión, los resultados confirman a A. deltaense M8R5 como un potencial agente causal de la enfermedad “raíces pilosas” en tomate y destacan el potencial de cepas de Bacillus como alternativas de biocontrol más sostenibles frente al uso de agroquímicos convencionales.