El presente estudio se enfocó en la detección molecular, mediante técnicas de PCR y RTPCR, de material genético de organismos del orden Piroplasmida, el género Rickettsia, así como de los 4 serotipos del virus del dengue (DENV) en sangre, bazo e hígado del murciélago vampiro común, Desmodus rotundus. Se capturaron 32 ejemplares en los estados de Querétaro, Hidalgo y Tabasco. Para la detección del gen 18S rRNA se implementaron 3 protocolos: PCR punto final, PCR semianidada y PCR anidada; de ellos, 14 muestras sanguíneas amplificaron fragmentos del tamaño esperado, aunque ninguna de las secuencias obtenidas resultó positiva para organismo del orden Piroplasmida. Tampoco se detectó la presencia de la proteína OmpB del género Rickettsia en ninguna muestras de bazo analizadas (0%). En contraste, 17 muestras hepáticas (53.12%) resultaron positivas para DENV-3, correspondientes a 13 ejemplares provenientes de Hidalgo (40.62%) y 4 de Tabasco (12.5%). Este es el primer estudio que reporta la presencia de DENV-3 en muestras biológicas de D. rotundus. La detección de estos agentes constituye una aproximación al estudio de D. rotundus como potencial reservorio de patógenos zoonóticos, y contribuye a la comprensión de la epidemiología y dinámicas de las enfermedades arbovirales.