De las enfermedades infecciosas que afectan a los seres humanos, la caries dental es probablemente la más prevalente, descrita como un proceso dinámico de desmineralización y remineralización, producto del metabolismo bacteriano sobre la superficie dentaria, que con el tiempo puede producir una pérdida de minerales y resultará en la presencia de una cavidad. El principal microrganismo asociado a la producción de caries es Streptococcus mutans (S. mutans); identificarlo y cuantificarlo directamente de la placa dentobacteriana es fundamental, surgiendo la necesidad de aumentar la selectividad en los medios de cultivo y de optimizar los procesos microbiológicos para aislarlo y cuantificarlo. Esta investigación tiene por objetivo principal desarrollar y evaluar una técnica para la aislación, identificción y recuento de S. mutans, mediante el uso del agar tripticasa de soya, extracto de levadura con sacarosa al 20% y bacitracina (TYS20B). Se llevó a cabo un estudio experimental in vitro. Para la evaluación de la técnica se obtuvieron 112 impresiones de las superficies oclusales de 18 niños que fueron agrupados en dos, un grupo de 8 niños para desarrollar la técnica (grupo experimental), y otro grupo de 10 niños a quienes se tomó una muestra inicial y otra muestra inmediatamete después realizar una técnica de cepillado para evaluar la técnica (grupo evaluado). Las muestras fueron tomadas con cucharillas individualizadas con agar TYS20B, las cuales se incubaron en una jarra de anaerobiosis en el laboratorio de Investigación de Licenciatura y Posgrados de Odontología de la Universidad Autónoma de Querétaro. Se identificaron y cuantificaron las colonias bacterianas directamente de las muestras tomadas bajo microscopía directa, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para comprobar la presencia de S. mutans. La técnica de impresión con agar TYS20B logró aislar y recuperar diversas morfologías de colonias de S. mutans a partir de placa dentobacteriana de la superficie oclusal de molares deciduos y permanentes. Con la técnica de impresión con agar TYS20B puede observarse la localización de las colonias bacterianas y el tipo de colonia de S. mutans directamente sobre una copia en negativo de la superficie oclusal. El agar TYS20B es fácil de elaborar, sin embargo es necesario respetar las cantidades de los componentes y no ejercer presión excesiva al tomar la muestra para que no se desgarre al agar.