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Title: Producción de las proteínas recombinantes α-lactoalbúmina y lactoferrina humanas y su escalamiento a nivel piloto
metadata.dc.creator: VIOLETA LOPEZ CALDERON
Keywords: MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD;CIENCIAS MÉDICAS
metadata.dc.date: 17-Jan-2019
Description: Las proteínas α-lactoalbúmina y lactoferrina humanas son dos glicoproteínas nativas de la leche materna que han demostrado múltiples beneficios nutricionales y como biofarmaceúticos. El objetivo del presente trabajo fue producir las proteínas recombinantes α-lactoalbúmina y lactoferrina humanas a nivel laboratorio (100 mL) y a nivel piloto (2 L). El sistema de expresión se conformó por la levadura Pichia pastoris como hospedero eucariota y el vector de expresión pGAPZαA, y, como hospedero procariota la bacteria E. coli TOP10. La transformación de E. coli Top 10 se llevó a cabo por el método del CaCl2/choque térmico, obteniéndose más de 25 transformantes/placa en medio selectivo con Zeocina™. La transformación de P. pastoris se llevó a cabo por electroporación, obteniéndose eficiencias de transformación entre 1.02 y 1.5 x 106 UFC/μg de DNA para ambas proteínas recombinantes. El análisis por SDS-PAGE demostró la producción de las proteínas recombinantes a nivel laboratorio. La producción de ambas proteínas se logró producir en biorreactor en volúmenes de 1-2 L de medio de cultivo, las condiciones de producción fueron 200 rpm, T=30 °C, 20 % de saturación mínima de oxígeno y 10 % v/v de inóculo. Los rendimientos máximos de proteínas recombinantes obtenidas a nivel piloto fueron 17.53 mg/L para la lactoferrina y 16.9 mg/L para la lactoalbúmina después de 12 horas de fermentación. Las proteínas recombinantes α-lactoalbúmina y lactoferrina fueron expresadas en el sistema heterólogo de P. pastoris a nivel laboratorio y la expresión de las proteínas recombinantes a nivel piloto debe ser optimizada evaluando el efecto de otros factores tales como la fuente de carbono, pH, tipo de cultivo, entre otros.
Both human α-lactalbumin and lactoferrin proteins are breast milk native glycoproteins that have shown multiple nutritional benefits and also as biopharmaceuticals. The aim of this job was to produce human recombinant α-lactalbumin and lactoferrin proteins at laboratory scale (100 mL) and at pilot scale (2 L). The expression system comprised the Pichia pastoris yeast as eukaryotic host and the pGAPZαA expression vector, and the E. coli TOP10 bacterium as prokaryote host. The transformation of E. coli TOP10 was carried out by CaCl2/heat shock method, obtaining more than 25 transformants/plate in selective medium with Zeocin™. The transformation of P. pastoris was carried out by electroporation, obtaining transformation efficiencies between 1.02 and 1.5 x 106 UFC/μg of DNA for both recombinant proteins. The SDS-PAGE analysis demonstrated the recombinant proteins production at laboratory scale. Both proteins production was achieved using a bioreactor in volumes of 1-2 L of culture media, production conditions were: 200rpm, T=30 °C, 20 % minimal oxygen saturation and 10 % v/v inoculum. The maximum yields of recombinant proteins obtained at the pilot scale were 17.53 mg/L for lactoferrin and 16.9 mg/L for α-lactalbumin after 12 hours of fermentation. The recombinant α-lactalbumin and lactoferrin and proteins were expressed in the heterologous system of P. pastoris at the laboratory scale and the expression of the recombinant proteins at pilot scale must be optimized by evaluating the effect of other factors such as the carbon source, pH, and type of culture, among others.
URI: http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/1416
Other Identifiers: Proteínas recombinantes
Biorreactor
Escalamiento
Pichia pastoris
Fermentación
Recombinant proteins
Bioreactor
Pichia pastoris
Fermentation
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